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木黴重寄生中幾丁質酶的代謝調控

在研究木黴重寄生防治治病真菌的過程中,細胞壁降解酶-幾丁質酶對降解拮抗微生物細胞壁起到重要作用。幾丁質酶系統與纖維素酶相似,可將幾丁質酶劃分為內切幾丁質酶、外切幾丁質酶和殼二糖酶。依據酶反應的最終產物將幾丁質酶分為三類:①內切幾丁質酶(EC3.2.1.14),該類酶可隨意裂解幾丁質和幾丁質寡聚物並釋放可溶性低分子量混合物,(GlcNAc)2即雙乙酰幾丁二糖是主要成分;②殼二糖酶,可從非還原端裂解幾丁質和幾丁質寡聚物[(GlcNAc)n],釋放的最終產物主要是(GlcNAc)2;③β-N-乙酰氨基己糖苷酶(EC3.2.1.52),同殼二糖酶壹樣可從非還原端裂解幾丁質和幾丁質寡聚物,釋放N-乙酰葡糖胺單體(GlcNAc),它也是唯壹可水解(GlcNAc)2的酶(楊合同等,2003)。真菌的幾丁質酶屬於糖苷水解酶類第18家族(glycoside hydrolase family 18,GH 18),根據幾丁質酶底物不同可將幾丁質酶分為三個亞群(Seidl,2008;Seidl et al.,2005):亞群A通常不含有碳水化合物綁定結構域(Carbohydrate Binding Modules,CBMs);亞家族B壹般在蛋白質C末端含有壹個CBM;亞家族C除含有多個CBMs外,在N端還有壹個或兩個CBM18鏈接的CBM50結構域。重寄生木黴含有亞家族B和C,腐生木黴含有亞家族C。深綠木黴和綠木黴編碼亞家族C的幾丁質酶基因分別為TAC和TVC(Gruber et al.,2005)。深綠木黴中,只有tvc4在孢子中表達,萌發15 h的菌絲中15個TVC基因都表達,而萌發25h後只有tvc4,tvc6,tvc7和tvc9表達,並且表達豐度相比15 h顯著降低(Gruber et al.,2011a,2011b)。培養基中添加葡萄糖可以誘導tvc4,tvc6和tvc7的表達量。剛果紅(Congo red)和卡爾科弗盧爾熒光增白劑(Calcofluor white)都可以結合真菌細胞壁中的葡聚糖和聚合幾丁質,培養基中添加可以誘導細胞壁脅迫。綠木黴對剛果紅極為敏感,1μg/mL的剛果紅雖然沒有改變幾丁質酶亞家族C的表達模式,但是顯著提高了表達量。在卡爾科弗盧爾熒光增白劑造成的細胞壁脅迫中,亞家族C的表達模式與剛果紅的影響差異顯著,兩種細胞壁脅迫試劑都可以上調tvc4 達,並下調tvc5和tvc11的表達。

在研究幾丁質酶合成和分泌的過程中發現:在深綠木黴tga1 功能缺失突變體△tga1中,幾丁質酶活性顯著下降,並伴隨著nag1和ech42 基因轉錄水平的降低。在深綠木黴P1中 tga1 編碼 G 蛋白的 a 亞基。tga1 功能缺失突變體完全喪失了對立枯絲核菌(R.solani)、葡萄孢菌(B.cinerea)和核盤菌(S.sclerotiorum)的重寄生活性。然而,在△tga1發酵液中含有更多的抑制葡萄孢菌孢子萌發的物質(Reithner et al.,2005)。在篩選耐受鐮胞菌(Fusarium spp.)分泌的毒素鐮刀菌酸(Fusaric acid,FA)實驗中,400ppm的FA可以顯著抑制nag1基因轉錄,並微弱下調ech42基因的表達,但是不抑制哈茨木黴S17TH分泌幾丁質酶(Sharma et al.,2012)。

總結

木黴最主要的繁殖方式是簡單的無性繁殖,然而信號在各元件的傳遞過程和由此產生的分子是非常復雜的。即使在實驗室條件下,研究者也會發現孢子形成過程還是不可預知的。孢子形成嚴格受到大量的不確定因素的組合影響,這些因素有光、機械損傷、碳源、氮源、環境pH值、鈣離子、周期節律、自身代謝物等(圖4.4)。木黴細胞在光和機械損傷條件下是否能產生孢子,主要取決於營養條件,而不是刺激本身。

圖4.4 木黴細胞中孢子形成的信號轉導通路示意

註:不同顏色表示不同的木黴種,藍色:深綠木黴(T.atroviride);黃色:綠木黴(T.virens);紅色:裏氏木黴(T.reesei);品紅:深綠木黴和綠木黴;綠色:深綠木黴和裏氏木黴;棕色:綠色木黴(T.viride);白色:未經實驗假設的途徑;HR:假設的受體(hypothetical receptor);R:PKA調控亞基;C:PKA催化亞基;BLR1和BLR2:藍光受體1和2。箭頭指代正調控,橫線指代負調控。實線表示已證明過程,虛線表示假設的調控

(Steyaert et al.,2010c)

明確特定木黴種類,甚至菌株的代謝對環境的適應性差異,將有助於生物防治菌株的設計、生產和應用。雖然木黴和其他真菌的光響應機制的研究已取得長足進步,但仍然缺乏對這個系統的全面了解:在不同環境條件下其功能如何調節。揭示直接或間接地與光信號相互作用的信號元件也是非常重要的,這樣才能明確光信號是如何傳遞並如何融入其他生理途徑的。全基因組基因表達分析表明:光誘導真菌保護自己免受光的有害影響,真菌反過來會激活各種機制以確保光信號的傳遞。但是對光信號與其他應激反應的聯系需要進壹步研究。對這些過程的了解將不僅能夠利用這些特性開發無數的木黴應用,同時也將有助於更深刻地洞察真菌如何設法在自然棲息地成功地生存。

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