近年來,紫外及可見光分光光度分析已得到廣泛的應用,它不僅可以用於物質的鑒定及結構分析,而且還可以用於某些物質含量的測定.
分光光譜技術可用於:
通過測定某種物質吸收或發射光譜來確定該物質的組成.
通過測量適當波長的信號強度確定某種單獨存在或與其他物質混合存在的壹種物質的含量.
通過測量某壹種底物消失或產物出現的量同時間的關系,追蹤反應過程.
壹、紫外及可見光分光光度法這是壹種只在可見光及紫外光光譜應用範圍內測量物質吸收輻射線的技術,應用十分廣泛.其中分光光度計可用於精確測量特定波長的吸收值,而比色計則是壹種較簡單的測量儀器,其原理是利用慮光片來測量較寬波段(如可見光中的綠光、紅光或藍光範圍)的吸收值.
光吸收法則:
溶液對光的吸收有兩個基本法則:
透過溶液的光的吸收值同吸收溶質的分子數目(即溶質濃度[C])呈指數相關.
透過溶液的光的吸收值同透過吸收溶液的路徑長度l成指數相關.
這兩條法則包括在比爾-朗伯關系式中.通常以入射光(Io)和出射光(I)的光密度來表示:
ε其中ε對於吸收物質及波長是壹個常數,稱為吸光系數或吸收系數,[C]的單位為mol/L或g/L,l的單位為ml.這壹公式非常有用,因為大多數分光光度計設計為直接測量log10(Io/I)的值(A)或消光值(E)(舊教材中可能使用以廢除的術語:光密度).對於遵循比爾-朗伯關系的物質,A與C呈線性關系.吸收值常用下標表示其波長,如A550表示550nm處的吸收值.透過溶液的光的比例稱為透光率(T),可由出射光和入射光的比值求得.
吸收值(A)(absorbance)--由公式得出:
透光率(T)(transmittance)--通常以百分數表示:T=(I/Io)×(壹)比色計比色計用於測定顏色明顯,並且是溶液主要組分的待測物,如血液中的血紅細胞,也可以在待測物之中加入壹種試劑,使其形成有色產物(壹種生色團),如用茚三酮法測定氨基酸含量.定量分析某種物質要做標準曲線,標準曲線是在測定待測樣品的同時測定已知含量的物質來制成的,而不是使用比爾-朗伯關系.
光源通常為鎢絲燈泡,通過壹個凸透鏡聚焦後產生壹束平行光,平行光穿過裝有溶液的玻璃樣品或小池,然後透過壹個有色濾光片到達光電管檢測儀,檢測儀產生壹個同落在光電管上的光密度成正比的電勢,來自於光電管的信號被放大然後傳遞到電流計或數字讀數器.
比色計的使用:
①接通電源使儀器穩定,使用前至少要讓燈預熱5min;② 選擇壹種同底物顏色互補的濾光器;③調零(用空白對照調零);④調整靈敏度;⑤分析樣品及標準溶液;⑥由於不同比色杯的吸光特性、杯壁厚度不同,因此為了提高精確度,同壹試驗應用同壹比色杯,且在比色槽中擺放的方位相同;⑦每次測樣前清洗比色杯;⑧經常重復測定同壹溶液檢驗比色計的可重復性;⑨用標準溶液繪制標準曲線.
由於大多數過濾器過濾出來的光的波帶很寬,因而比色計既不能用於確定某種復合物,也無法分辨在混合液中吸收特性非常相近的兩種物質.比色計所用光電管的變化系數為0.5%左右,因而不適合要求具有高度精確性的工作.使用這種最簡單的儀器,由於儀表上對數測量刻度單位的隨意性,即使是把表上的靈敏度/刻度調節到零控點,在壹個儀器上獲得的值不可直接同另壹臺儀器上測得的值相比較,同壹儀器的不同設置之間也不可直接比較.比色計對於特定波長的量化工作是不合適的.
(二)紫外光/可見光分光光度計紫外光/可見光分光光度計基本裝置中采用高強度的鎢燈作為光源,能夠在可見光範圍(400~700nm)調節.氘燈用於紫外分光光度測量(200~400nm);使用氘燈時要用石英杯,因為紫外線不能透過玻璃.
分光光度計之所以優於比色計就在於使用了壹個衍射光柵將光源的復色光轉換為單色平行光束.實際上從這種單色壹種產生的光不是某個波長的光,而是壹段窄的帶寬上的光,帶寬是分光光度計的壹個重要特性,這是由於它決定了吸收測量中所用的波長--普通分光光度計的帶寬為5~10nm,用於研究的儀器的帶寬小於因為光柵夾縫的寬度影響著帶寬,帶寬隨光柵夾縫的寬度的減少而降低,要獲得特定波長下的精確數據,盡可能使用最小的縫寬度.然而,減少了縫寬也會減少到達監測器的光度,降低了信/噪比.縫寬可減少的程度取決於檢測/放大系統的靈敏度及穩定性於離散光的存在.
大多數UV/可見光分光光度計使用的比色杯的光穿過路徑為10nm.壹次性塑料杯適合於對水和乙醇溶液在可見光範圍內的測量.玻璃比色杯的生產要求更加嚴格的標準,因而在精確研究中要使用玻璃比色杯,尤其當溶液的吸收值很低時(<0.1),即使盛對照液與待測樣品液的比色杯在光學性質上有稍許不同,也會導致結果偏差.玻璃和塑料會吸收UV光,因此在測波長小於300nm的吸收值時要使用石英杯.
進行測量之前,比色杯要保證幹凈,無劃痕,外表面幹燥,盛液到適當高度,並放在了比色槽中的正確位置.生物樣品中蛋白質和核酸可能會在玻璃/石英杯的內表面沈積,因而要用棉球沾上丙酮擦去比色杯內的沈澱或用1mol/L硝酸浸泡過夜.腐蝕性及毒性溶液必須使用有蓋子的比色杯,以防止濺出,破壞儀器.
基本分光光度計使用的光電管類似於比色計中所使用的光電管.許多情況下,當波長高於和低於550~600nm時必須使用不同的光電管,這是因為它們在可見光波長內的靈敏度不同,更精彩的儀器中所使用的是具有比光電管更高的靈敏度和穩定性的檢測器.數字顯示由於不易產生視覺錯誤和誤讀範圍的錯誤,正逐漸代替指針讀數.壹些儀器可以直接給出所測定物質的濃度.
.紫外光/可見光分光光度計的類型:
基本分光光度計只產生單束光.這種儀器首先用空白對照調到零吸收值,然後取出空白液,加入待測液,測定待測液的吸收值.也有壹種雙束分光光度計,有單色光源產生的光束被分為兩束,壹束穿過待測液,另壹束穿過空白液.吸收值由壹個電子線路通過對比透過待測液及空白液的出射光進行測定.雙光束分光光度計減少了由於光源輸出的不穩定或檢測系統靈敏度的變化而導致的測量錯誤,這時由於待測液與對照液是同時進行測量的.記錄式分光光度計是壹種雙束測定儀,用於記錄已知波段下吸收值隨時間的變化(如用於酶分析).
.分光光度計的定量分析:
假如已知壹種物質在某壹波長下的吸光率(通常是該物質的最大吸收值,這時靈敏度最高),這種物質純溶液的濃度可用比爾-朗伯關系式算出.摩爾吸光系數是指物質在1mol/L的濃度下,比色杯厚度為1cm時的吸收值.該值可以從光譜數據表中查到,也可以用實驗方法通過測量壹系列已知濃度的物質的吸收值來繪制壹條標準曲線.這樣,在所要求的濃度範圍內,便可確定吸收值與濃度之間存在的線性關系,該直線的斜率即為摩爾吸光系數.
比吸光率是指物質質量溶液濃度為10g/L時,比色杯厚度為1cm時測定的吸光值.該值對於未知分子質量的物質如蛋白質核酸的測定很有用,這種情況下溶液中物質的含量以其質量表示而不用摩爾濃度表示.使用公式Log10(Io/I)=εl[C]時,比吸光率要除以10才可以得到壹個以g/L為單位的濃度值.
這種簡單的方法不能用於測定混合樣品.在這種情況下,也許可以通過測量幾個波長下的吸光度來估算每種成分的含量,如可用此方法在核酸存在下進行蛋白質含量的估算.
分光光度計的使用方法:
(1)接通電源;(2)使用前預熱15min;(3)選擇波長;(4)選擇檢測器;(5)如果可能的話,選擇正確的縫寬;(6)插入適當的空白對照;(7)調解到0%的透過率;(8)將吸光值調到零;(9)分析樣品;(10)每測量10個樣品後,用空白對照校驗零刻度;(11)檢測儀器的可重復性.