簡稱PCR。聚合酶鏈反應(PCR)是壹種體外酶促合成特定DNA片段的方法，由高溫變性、低溫退火(復性)和適當的溫度延伸等幾個反應組成，在壹個循環中進行，使目的DNA快速擴增，具有特異性強、靈敏度高、操作簡單、省時等特點。它不僅可以用於基因分離、克隆和核酸序列分析等基礎研究，還可以用於疾病診斷或任何有DNA和RNA的地方。聚合酶鏈反應(Polymerase Chain Reaction，PCR)又稱無細胞分子克隆或特定DNA序列的體外引物導向酶促擴增技術。
編輯此段落的簡要歷史。
人類對核酸的研究已經超過100年。20世紀60年代末70年代初，人們致力於體外基因分離技術的研究。然而，由於核酸含量低，DNA的體外操作受到壹定程度的限制。科蘭納在1971年首次提出了體外核酸擴增的思想。但當時基因序列分析的方法還不成熟，對熱穩定性強的DNA聚合酶還沒有找到，寡核苷酸引物的合成還處於人工和半自動合成階段。這個想法似乎沒有什麽實際意義。1985年，美國科學家Kary Mullis在高速公路的啟發下，經過兩年的努力，發明了PCR技術，並在《科學》雜誌上發表了第壹篇關於PCR技術的學術論文。此後，PCR技術得到了生命科學界的廣泛認可，Kary Mullis從65438到0993年獲得了諾貝爾化學獎。但最初的PCR技術相當不成熟，是壹種操作復雜、成本高、“無用”的實驗室技術。在1988開頭，Keohanog通過改進所用的酶來提高擴增的真實性。隨後齋祀等人從生活在黃石國家公園溫泉中的水生嗜熱菌中提取了壹種耐熱的DNA聚合酶，大大提高了PCR技術的擴增效率。也正是因為這種酶的發現，使得PCR技術得到了廣泛的應用，成為遺傳和分子生物學分析的根本基石。在隨後的幾十年中，PCR方法得到了不斷的改進:從定性分析方法發展到了定量測定；從原來只能擴增幾個kb的基因，到現在可以擴增幾十個kb的DNA片段。到目前為止，有十幾種PCR技術，例如，將PCR與逆轉錄酶結合成為逆轉錄PCR，將PCR與抗體結合成為免疫PCR。
編輯本段的技術原理
DNA的半保守復制是生物進化和傳代的重要方式。雙鏈DNA可以在各種酶的作用下變性、熔化成單鏈，在DNA聚合酶和啟動子的參與下，根據堿基互補配對的原理，復制到同壹個雙分子貽貝中。在聚合酶鏈反應中
實驗中發現，DNA在高溫下可以變性熔化，降溫時可以復性成雙鏈。因此，可以通過改變溫度來控制DNA的變性和復性，設計引物作為啟動子，加入DNA聚合酶和dNTP，在體外完成特定基因的復制。但DNA聚合酶在高溫下會失活，因此每循環都需要添加新的DNA聚合酶，不僅操作繁瑣，而且價格昂貴，制約了PCR技術的應用和發展。發現耐熱的DNA聚合酶- Taq酶是PCR應用中的壹個裏程碑。該酶可以耐受90℃以上的高溫而不喪失活性，這使得PCR技術非常簡單，大大降低了成本。PCR技術已經得到廣泛應用，並逐漸應用於臨床。
編輯本段的工作原理
類似於DNA的自然復制過程，其特異性依賴於與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由三個基本反應步驟組成:變性-退火(復性)-延伸:①模板DNA的變性:模板DNA加熱到94℃左右時的聚合酶鏈式反應。
之後，模板DNA的雙鏈DNA或PCR擴增形成的雙鏈DNA被解離，從而可以與引物結合，為下壹輪反應做準備；(2)模板DNA與引物的退火(復性):模板DNA加熱變性成單鏈後，降溫至40-60℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；③引物延伸:DNA模板-引物偶聯物，在DNA聚合酶的作用下，在72℃左右，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，根據堿基配對和半保守復制的原理，合成壹條與模板DNA鏈互補的新的半保守復制鏈，重復循環變性-退火-延伸三個過程，可以得到更多的“半保守復制鏈”，這條新鏈可以作為下壹個循環的模板。完成壹個循環需要2 ~ 4分鐘，待擴增的目的基因在2 ~ 3小時內可擴增百萬倍。
編輯本段的反應特征
高特異性PCR反應的特異性決定因素是:①引物和模板DNA的特異性正確組合；②堿基配對原理；③Taq DNA聚合酶合成反應的真實性；④目的基因的特異性和保守性。引物和模板的正確組合是關鍵。引物與模板的結合和引物鏈的延伸遵循堿基配對的原理。由於聚合酶合成反應的保真性和Taq DNA聚合酶的耐高溫性，反應中模板和引物的結合(復性)可以在較高的溫度下進行，結合的特異性大大增加，擴增的目的基因片段可以保持較高的準確性。通過選擇特異性高、保守的靶基因區域，其特異性會更高。靈敏度高的PCR產物量呈指數級增加，可將初始待測模板按皮克(pg=10-12)級擴增到μg=10-6的水平。可以從654.38+0萬個細胞中檢測出壹個目標細胞；在病毒檢測中，PCR的靈敏度可達3 RFU(空斑形成單位)；在細菌學中，最低檢出率為3個細菌。簡單快速的PCR反應使用耐高溫的Taq DNA聚合酶。反應液壹次性加入後，在DNA擴增液和水浴鍋中進行變性-退火-延伸反應，擴增反應壹般在2 ~ 4小時內完成。擴增產物壹般用電泳分析，不需要同位素，所以沒有放射性汙染，易於推廣。標本純度低，不需要分離病毒或細菌和培養細胞。粗DNA和RNA可以用作擴增模板。可直接用於血液、體腔液、漱口液、頭發、細胞、活組織等臨床標本的DNA擴增和檢測。
編輯本段的五個元素
參與PCR反應的主要物質有五種，即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+引物。引物是PCR特異性反應的關鍵，PCR產物的特異性取決於引物和模板DNA之間的互補程度。理論上，只要已知任何模板DNA的序列，就可以根據它設計互補的寡核苷酸鏈作為引物，通過PCR在體外擴增模板DNA。引物的設計應遵循以下原則:①引物長度:15-30bp，壹般在20bp左右。②引物擴增跨度:200-500bp為宜，在壹定條件下可擴增到10kb片段。③引物堿基:G+C的含量應在40-60%，G+C過少不利於擴增，G+C過多易產生非特異性條帶。ATGC最好隨機分布，以避免超過5個嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。(4)避免引物中的二級結構，避免兩條引物之間的互補性，尤其是3’端的互補性，否則會形成引物二聚體，產生非特異性擴增帶。⑤引物3’端的堿基，尤其是最後壹個和倒數第二個堿基要嚴格匹配，避免末端堿基錯配導致PCR失敗。⑥引物中存在或可以存在合適的酶切位點，擴增的目的序列最好有合適的酶切位點，這對酶切分析或分子克隆非常有利。⑦引物特異性:引物應與核酸序列數據庫中的其他序列無明顯同源性。引物量:每種引物的濃度為0.1 ~ 1 umol或10 ~ 100 pmol，最低的引物量更好產生所需的結果。較高的引物濃度會造成錯配和非特異性擴增，增加引物間形成二聚體的機會。
在本段中編輯反應系統和反應條件。
標準PCR反應系統:10×擴增緩沖液10ul四種dNTP混合物，每種混合物含有200 μm ol/L引物10 ~ 100 pmol模板DNA 0.1 ~ 2ug Taq DNA聚合酶2.5u Mg2+1.5mmol/ L向100 ul中加入雙份或三份蒸餾水。PCR反應五要素:參與PCR反應的物質主要有五種，分別是引物、酶、dNTP、模板和緩沖液(需要Mg2+)。
選擇PCR反應條件來編輯這壹段
PCR的反應條件是溫度、時間和循環次數。溫度和時間的設定:基於PCR原理，設定變性-退火-延伸三個溫度點。在標準反應中，使用三溫點法。雙鏈DNA在90 ~ 95℃變性，然後迅速冷卻到40 ~ 60℃。引物退火後與靶序列結合，然後快速加熱至70 ~ 75℃。在Taq DNA聚合酶的作用下，引物鏈沿著模板延伸。對於較短的靶基因(長度為100 ~ 300 BP時)，可采用雙溫點法，除變性溫度外，可結合退火和延伸溫度。壹般94℃變性，65℃左右退火延伸(在此溫度下，Taq DNA酶仍具有較高的催化活性)。①變性溫度和時間:變性溫度低和熔化不完全是PCR失敗的主要原因。壹般來說，93℃ ~ 94℃的時間足以使模板DNA變性。如果低於93℃，需要延長時間，但溫度不能太高，因為高溫環境對酶的活性有影響。如果目標基因模板或PCR產物在這壹步不能完全變性，PCR就會失敗。②退火(復性)溫度和時間:退火溫度是影響PCR特異性的重要因素。變性後迅速降溫至40℃ ~ 60℃，可使引物與模板結合。因為模板DNA比引物復雜得多，所以引物和模板之間碰撞結合的幾率比模板互補鏈之間的幾率高得多。退火溫度和時間取決於引物的長度、堿基組成和濃度以及靶序列的長度。對於20個核苷酸和50% G+C含量的引物，55℃是選擇最佳退火溫度的理想起點。引物的復性溫度可以通過下式幫助選擇合適的溫度:Tm值(解鏈溫度)=4(G+C)+2(A+T)復性溫度=Tm值-(5 ~ 10℃)在Tm值允許的範圍內，選擇較高的復性溫度可以大大降低引物與模板的非特異性結合，提高PCR反應的特異性。復性時間壹般為30 ~ 60秒，足以使引物和模板完全結合。③延伸溫度和時間:Taq DNA聚合酶生物活性:70 ~ 80℃ 150核苷酸/秒/酶分子70℃ 60核苷酸/秒/酶分子55℃ 24核苷酸/秒/酶分子90℃以上，DNA合成幾乎不能進行。PCR反應的延伸溫度壹般為70 ~ 75℃，常見溫度為72℃。過高的延伸溫度不利於引物和模板的結合。PCR延伸反應的時間取決於待擴增片段的長度。壹般對於1Kb以內的DNA片段，1min的延伸時間就足夠了。3 ~ 4 KB的靶序列耗時3 ~ 4min；10Kb的擴增需要延伸到15min。過長的延伸會導致非特異性擴增帶的出現。對於低濃度模板的擴增，延伸時間稍長。
編輯該酶及其濃度。
目前可用的Taq DNA聚合酶有兩種，壹種是從水熱芽孢桿菌中純化的天然酶，另壹種是大腸桿菌合成的基因工程酶。催化壹個典型的PCR反應大約需要2.5U的酶(當總反應體積為100ul時)。濃度過高會引起非特異性擴增，濃度過低則合成產物量減少。dNTP的質量和濃度與dNTP的質量和濃度以及PCR擴增的效率密切相關。dNTP粉末是顆粒狀的，如果保存不當很容易失去生物活性。DNTP溶液呈酸性，應在高濃度後用1M NaOH或1M Tris配制。將HCL緩沖液的PH值調至7.0 ~ 7.5，少量分裝，冷凍於-20℃。反復凍融會降解dNTP。在PCR反應中，dNTP應在50 ~ 200 μm ol/L，特別是四種dNTP的濃度應相等(等摩爾配制)。如果其中任何壹個和其他的不壹樣(更高或更低)，就會造成不匹配。過低的濃度會降低PCR產物的產量。DNTP能與Mg2+結合，降低遊離Mg2+的濃度。模板(靶基因)核酸模板核酸的數量和純化程度是PCR成敗的關鍵環節之壹。傳統的DNA純化方法通常使用SDS和蛋白酶K來消化和處理樣品。SDS的主要作用是:溶解細胞膜上的脂質和蛋白質，從而溶解膜蛋白破壞細胞膜，遊離細胞內的核蛋白。SDS也能與蛋白質結合沈澱；蛋白酶K能水解和消化蛋白質，尤其是與DNA結合的組蛋白，然後用有機溶劑苯酚和氯仿提取蛋白質和其他細胞成分，用乙醇或異丙醇沈澱核酸。提取的核酸可以用作PCR反應的模板。在壹般的臨床樣本中，可以用壹種快速簡便的方法溶解細胞，裂解病原體，消化染色體的蛋白質，使目的基因遊離出來，直接用於PCR擴增。RNA模板的提取通常采用異硫氰酸胍或蛋白酶K法，防止RNA酶降解RNA。Mg2+濃度對PCR擴增的特異性和產量有顯著影響。在壹般的PCR反應中，當各種dNTP的濃度為200 μm ol/L時，Mg2+的適宜濃度為1.5 ~ 2.0 mmol/L..Mg2+濃度過高，反應的特異性會降低，出現非特異性擴增。濃度過低，Taq DNA聚合酶的活性會降低，反應產物也會減少。
編輯此工作步驟。
PCR反應的基本過程
標準的PCR過程分為三步(如圖):1。DNA變性(90℃-96℃):在熱的作用下，雙鏈DNA模板的氫鍵斷裂，形成單鏈DNA；2.退火(復性)(40℃-65℃):系統溫度降低，引物與DNA模板結合形成局部雙鏈。3.延伸(68℃-75℃):在Taq酶的作用下(最好的活性在72℃左右)，以dNTP為原料，從引物的5’端延伸到3’端，合成壹條與模板互補的DNA鏈。在每個循環中的變性、退火和延伸之後，DNA含量加倍。目前有些PCR由於擴增區域很短，即使Taq酶活性不是最適，也能在短時間內復制，因此可以改為兩步法，即退火和延伸在60℃-65℃同時進行，以減少壹次加熱和冷卻過程，提高反應速度。
編輯此段落的循環參數。
1，初始變性。模板DNA的完全變性對PCR的成功至關重要，通常在95℃加熱3-5分鐘。2.引物退火的退火溫度壹般由實驗(經驗)決定。退火溫度對PCR的特異性有很大影響。3.引物延伸引物延伸壹般在72℃(Taq酶的最適溫度)進行。延伸時間取決於擴增片段的長度和所用Taq酶的擴增效率。4.循環中的變性步驟:壹般95℃30秒就足以使循環中的各種靶DNA序列完全變性:變性時間過長會破壞酶的活性，過短時靶序列沒有完全變性，容易造成擴增失敗。5、循環數大多數PCR包含25-35個循環，容易產生非特異性擴增。6.最後，最後壹個循環後，在72℃下維持反應5-15分鐘，使引物完全延伸，單鏈產物退火成雙鏈。PCR-PCR常見問題
編輯該電泳檢測時間。
壹般是48小時以內，有些比當天電泳檢測要好。超過48小時後，帶型不規則，甚至消失。無擴增帶的假陰性PCR反應的關鍵環節是①模板核酸的制備，②引物的質量和特異性，③酶的質量，④PCR循環條件。要找到原因，也要對以上環節進行分析研究。模板:①模板中含有蛋白質，②模板中含有Taq酶抑制劑，③模板中的蛋白質未被消除，尤其是染色體中的組蛋白，④模板的提取和制備過程中丟失過多，或吸入苯酚。⑤模板核酸沒有完全變性。當酶和引物的質量良好時，沒有擴增帶，這很可能是由於樣品的消化和模板核酸提取過程的失敗。所以為了配制有效穩定的消化液，程序要固定，不能隨意更改。酶失活:需更換新酶或新舊酶同時使用，分析假陰性是否因酶活性喪失或不足所致。需要註意的是，Taq酶或溴化乙錠有時會被遺忘。引物:引物的質量、引物的濃度、兩個引物的濃度是否對稱是PCR失敗或擴增帶不理想的常見原因，容易分散。部分批次的引物合成質量存在問題。兩個引物中的壹個濃度高，另壹個濃度低，導致不對稱擴增效率低。對策如下:①選擇好的引物合成單個位置。②引物的濃度不僅取決於OD值，還取決於引物原液的瓊脂糖凝膠電泳。壹定要有引物帶，兩條引物帶的亮度要大致相同。比如壹個引物有帶，另壹個引物沒有帶，此時PCR可能會失敗，要和引物合成單位協商解決。如果壹種底漆亮度高，另壹種亮度低，稀釋底漆時濃度要平衡。(3)引物應高濃度小包裝保存，避免引物因反復凍融或長期存放在冰箱中而變質降解。④引物設計不合理，如引物長度不夠，引物之間形成二聚體。Mg2+濃度:Mg2+離子濃度對PCR擴增效率有很大影響。濃度過高會降低PCR擴增的特異性，濃度過低則會影響PCR擴增的產量，甚至使PCR擴增失敗而不產生擴增帶。反應體積的變化:通常，用於PCR擴增的體積為20ul、30ul和50ul。或者100ul，PCR擴增要用哪個體積是根據科研和臨床檢測的不同目的來設定的。做小體積的時候，比如20ul，壹定要設置好模式條件，否則很容易失敗。
編輯本段的物理原因。
變性對PCR擴增很重要，如變性溫度低、變性時間短，極易出現假陰性；過低的退火溫度會導致非特異性擴增，降低特異性擴增效率。過高的退火溫度會影響引物和模板的結合，降低PCR擴增效率。有時需要用標準的溫度計來檢測擴增器或水溶鍋中的變性、退火和延伸溫度，這也是PCR失敗的原因之壹。靶序列的變異:如果靶序列發生突變或缺失，影響引物與模板的特異性結合，或者由於靶序列的某壹段缺失導致引物與模板失去互補序列，其PCR擴增就不會成功。假陽性PCR擴增條帶與靶序列條帶壹致，有時條帶更整齊、更亮。引物設計不當:選擇的擴增序列與非靶擴增序列具有同源性，因此在進行PCR擴增時，擴增出的PCR產物是非靶序列。如果靶序列太短或引物太短，容易出現假陽性。引物需要重新設計。靶序列或擴增產物的交叉汙染:這種汙染有兩個原因:壹是全基因組或大片段的交叉汙染導致假陽性。這種假陽性可以通過以下方法解決:操作要小心輕柔，防止靶序列被吸入裝填槍或濺出離心管。除酶和不能耐高溫的物質外，所有試劑或設備都要高壓滅菌。使用的離心管和進樣槍頭應壹次性使用。必要時，在添加樣品之前，用紫外線照射反應管和試劑以破壞存在的核酸。二是空氣中核酸小片段的汙染，這些小片段比靶序列短，但有壹定的同源性。它們可以相互拼接，與引物互補後，PCR產物可以擴增，產生假陽性，通過巢式PCR可以減輕或消除。出現非特異性擴增帶。PCR擴增後的條帶與預期大小不壹致，或大或小，或特異性擴增條帶和非特異性擴增條帶同時出現。出現非特異性條帶的原因有兩個:壹是引物與靶序列不完全互補，或者引物聚合形成二聚體。第二，Mg2+離子濃度過高和退火溫度過低與PCR循環次數過多有關。其次是酶的質量和數量，往往某些來源的某些酶容易出現非特異性條帶而另壹些則不會，有時酶量過高會出現非特異性擴增。對策是:必要時重新設計指南。減少酶的用量或從其他來源更換酶。減少引物的用量，適當增加模板的用量，減少循環次數。適當提高退火溫度或采用雙溫點法(93℃變性，65℃左右退火延伸)。PCR擴增有片曳或塗抹帶，有時出現塗抹帶或片帶或地毯樣帶。原因往往是酶太多或酶質量差，dNTP濃度太高，Mg2+濃度太高，退火溫度太低，循環次數太多。對策是:減少酶的用量，或者換其他來源的酶。②降低dNTP濃度。適當降低Mg2+的濃度。增加模板數量，減少循環次數。
編輯這個克隆的PCR產物。
1)克隆PCR產物的最佳條件是什麽？最佳的插入片段:載體比例需要通過實驗來確定。1: 1(插入:向量)往往是最佳比例，1: 8或8: 1的摩爾比也是可以接受的。應確定比率範圍。連接用5ul 2X連接酶，50ng質粒DNA，1Weiss T4連接酶，插入片段為10ul。保持溫度在室溫65438±0小時，或在4℃過夜。在這兩個溫度下，缺乏T- projection的載體會自我連接，產生藍點。在室溫下保持溫度1小時可以滿足大部分克隆要求。為了提高連接效率，需要在4℃過夜。2)2)PCR產物需要凝膠純化嗎？比如凝膠分析只有壹條帶，不需要凝膠純化。如果還能看到其他條帶，可能是二聚體積累了大量引物。少量的引物二聚體也具有高摩爾數，這將產生高比例的具有引物二聚體的克隆，而不是目標插入片段。所以克隆前需要凝膠純化。3)如果沒有回收到目標片段，需要做什麽對照實驗？a)包被未轉化的感受態細胞。如果有菌落，說明氨芐青黴素無效，或者有氨芐青黴素抗性的質粒被汙染，或者產生了氨芐青黴素抗性的菌落。b)轉化完整質粒，計算菌落生長數，並確定轉化效率。例如稀釋1ug/ul質粒1:100，用1ul轉化100ul感受態細胞。用SOC稀釋到1000ul後，在板材上鋪100ul。過夜培養後，產生了1000個菌落。轉化率為:產生的菌落總數DNA擴散總數。鋪板DNA的總量是轉化反應中使用的量除以稀釋倍數。具體是用10ng DNA進行轉化，用SOC稀釋到1000u後，含有10 ng DNA，用1/10鋪展，共享1 ng DNA。轉化率為:1000個克隆x 10(立方)ng/鋪板1 ng DNA ug = 10(立方)cfu/ ug轉化pGEM-T應用10(立方)cfu/ ug感受態細胞，若無集落或集落少，則易感細胞易感。c)使用pGEM-T陽性對照或PCR產物產生>:20-40個藍點(使用指定的step 10(8次方)cfu/ ug感受態細胞)，表明載體丟失了T..可能是連接酶汙染了核酸酶。T4 DNA連接酶(M1801，M1804，M1794)質量標準好，無核酸酶汙染，其他來源的T4 DNA連接酶不宜替代。d)用pGEM-T或pGEM-T Easy vector轉化高頻感受態細胞(10(8次方)cfu/ug)，按照規定的實驗步驟，可獲得100個菌落，其中60%應為白色斑點，如>:20-40個藍色斑點，無菌落或很少菌落，連接問題。4)對照實驗的結果是好的，但是沒有回收到目標片段。實驗有什麽問題？a)連接在室溫下保持65438±0小時，可以滿足大部分克隆。為了提高效率，需要在4℃過夜。b)插入的片段被汙染，導致3’-T的缺失，或連接和轉化的抑制。因此，將插入的片段與pGEM-T陽性對照混合，然後連接。如果對照的菌落數減少，插入的片段需要純化或重新制備。如果產生大量藍點，說明插入的片段被核酸酶汙染，使pGEM-T或pGEM-T易載體3′-T缺失。c)插入片段不適合連接。由於過度的紫外線照射，有時會出現凝膠純化的插入物。過多的紫外線照射會產生嘧啶二聚體，不利於連接，DNA必須再次純化。d)具有修復功能的耐熱DNA聚合酶的擴增產物末端沒有A，這是克隆pGEM-T或pGEM-T Easy載體所需要的。加入Taq DNA聚合酶和核苷酸可以在末尾加壹個。詳情請參考pGEM-T pGEM-T Easy carrier (TM042)的技術數據。e)高度重復的序列可能不穩定，導致擴增過程中的缺失和重排。如果發現插入經常被刪除和重排，應使用重組缺陷型大腸桿菌菌株，如SURE細胞。
編輯此PCR反應的分類。
重疊PCR
重疊擴增基因拼接法是壹種基於普通PCR技術的基因融合和定點突變的有效方法。眾所周知，引物只需要與模板有效結合即可，尤其是5’端序列不需要與模板完全配對，因此可以在擴增引物的5’端添加壹個甚至兩個限制性位點，以便後期克隆。SOEing方法正是利用了這壹特性，將新序列混合到兩個獨立的基因中，達到兩個基因之間存在重疊區域的目的，3’端的結合使得基因融合或定點突變成為可能。
逆轉錄聚合酶鏈反應
RT-PCR是逆轉錄PCR和實時PCR的通用縮寫。逆轉錄-PCR (RT-PCR)是聚合酶鏈式反應(PCR)的壹種廣泛使用的變體。在RT-PCR中，RNA鏈被逆轉錄成互補的DNA，然後被用作PCR擴增DNA的模板。