雖然大腸桿菌E.coli 表達系統經濟實惠，但由於缺乏重要的脂類，分子螫合物，以及重要的翻譯後修飾，用它表達真核蛋白，可能會影響蛋白本身的折疊及功能，以膜蛋白為例，大腸桿菌表達系統能影響目標蛋白在細胞膜的插入位置、及其應有的功能[1]。除此之外，當目標蛋白大於 50kDa 時，使用大腸桿菌系統可能表達出不完整的蛋白[2]。
先前已經提到 Strep-tag? 的歷史（點此回顧），現在我們將著重介紹 Strep-tag? 在哺乳類細胞表達系統的應用。
雖然大腸桿菌E.coli 表達系統經濟實惠，但由於缺乏重要的脂類，分子螫合物，以及重要的翻譯後修飾，用它表達真核蛋白，可能會影響蛋白本身的折疊及功能，以膜蛋白為例，大腸桿菌表達系統能影響目標蛋白在細胞膜的插入位置、及其應有的功能[1]。除此之外，當目標蛋白大於 50kDa 時，使用大腸桿菌系統可能表達出不完整的蛋白[2]。
所以，為了研究特定蛋白的功能（如：信號通路）、生產較大型的蛋白，或進行高解析度的結構分析，愈來愈多的實驗組選擇哺乳類表達系統來生產融合蛋白。其原因為哺乳動物細胞生產出的重組蛋白與人類蛋白十分相似，有較完整的蛋白折疊、組合及翻譯後修飾[3]。因此，愈來愈多科學家們更加關註於—如何從哺乳類細胞中高效的純化目標蛋白。
親和標簽的選擇
首先，需考慮選擇合適的親和標簽。常用於哺乳動物表達系統的親和標簽有 His-tag、FLAG-tag、GST-tag及 Strep-tag? 等[4-12]，整理於下表：
這些親和標簽在使用上各有千秋。
使用 His-tag 時，常遇到的問題是寄主蛋白與填料的非特異性結合，在哺乳動物重組蛋白的純化過程中，這樣的情況更為明顯。由於系統中有很多含有組氨酸（histidine）的殘基的蛋白，這種蛋白結構與 his-tag 相似，容易與鎳柱結合，因此導致目標蛋白純度降低[13]。
FLAG-tag 系統可在非變性條件下進行純化，能得到高純度、有活性的蛋白，但其缺點為純化介質較為不穩定，且純化成本高上許多[5]。
另壹常用的標簽為GST-tag，壹個26kDa 的蛋白，其特點是表達量高，具高度抗原性，常用來增加目標蛋白的溶解度，但常常會影響目標蛋白的特性，壹般推薦純化後將標簽去除[8]。
而Strep-tag?（包含Strep-tag?II或是Twin-Strep-tag?），都是短肽標簽，分別為8 或28 個胺基酸，壹般不幹擾蛋白折疊或活性，因此適合用於蛋白功能性研究[5]。 Strep-tag? 可以特異性的結合在 Strep-Tactin? (二代介質) 或 Strep-Tactin?XT (三代介質) 的生物素的結合位點。洗脫時使用的脫硫生物素（適用於二代）或生物素（三代），對同樣的結合位點有更高的親和力，能將目標蛋白從同樣位置移除，因此得到的目標蛋白純度壹般高於95%[12]。
同時，三代Strep-Tactin?XT 與Strep-tag? 蛋白的親和力大幅提升，直接加入含目標蛋白的哺乳細胞的培養上清，即可高效純化出所需蛋白（註: 原本使用二代需先以Avidin 或是BioLock 將培養基中的生物素遮蔽，才不會影響純化表現）。
三代 Strep-Tactin?XT 親和力顯著
圖 A 比較了 His-tag 與 Strep-tag? 直接加入哺乳細胞培養上清純化目標蛋白的表現。
圖A：分別向Strep-Tactin?XT High Capacity 1ml 重力柱（左）和Ni-NTA 1ml 重力柱（右）中，同時加入含4mg mCherry-Twin-Strep-tag (TST) 或mCherry-His-tag (His) 螢光蛋白的ExpiCHO 細胞培養上清（註: 接下來的實驗皆是取哺乳細胞表達某抗體後的上清，另加入高純度目標蛋白進行實驗)。由圖可見，Strep-Tactin?XT（左）能高效率的捕捉 mCherry-TST，而右方的 mCherry-His 幾乎無法掛柱。
此外，我們也測試了其他的蛋白，例如 SEAP (72 kDa) 或抗體 (mAb，其重煉為 55 kDa)。圖 B 為以 Strep-Tactin?XT 純化 SEAP-TST、mCherry-TST與 mAb-TST 的 SDS-PAGE 分析結果，可見對於不同蛋白，Strep-tag? 系統都能純化出高純度的目標蛋白。 (註: 紅色標記處為 mCherry 的降解產物，非雜帶)
圖B
因 Strep-Tactin?XT 與 Twin-Strep-tag 蛋白的高親和力，即使目標蛋白的濃度低，使用 Strep-Tactin?XT 仍可以有效的捕捉上清中的目標蛋白。表 C 整理了幾個實驗的數據，顯示當目標蛋白濃度低於 20 μl/ml 時，得率仍能達到幾近 100%。
表C
Strep-Tactin?XT 普適性高
除了上述實驗所用的 CHO 細胞株外（中國倉鼠卵巢細胞），另壹常用於生產蛋白的哺乳動物細胞株為 HEK293(人胚胎腎細胞)，使用上較 CHO 簡單。我們測試了 Strep-Tactin?XT 的純化表現 : 表 D1 為以 Expi293 表達 SEAP-TST 或 mCherry-TST 蛋白後，目標蛋白的濃度。圖 D2 為純化表現的 SDS-PAGE 分析。從中可知，與 ExpiCHO 培養基相同，直接將表達好的 Expi293 上清加入 1 ml Strep-Tactin?XT 高載量重力柱中進行純化，壹樣能夠快速的得到高純度的目標蛋白。
表D1
圖D2
綜上所述，Strep-tag? 非常適合用在哺乳動物細胞系中表達目標蛋白，其純化過程也與常見的 ExpiCHO 及 Expi293 培養基相容，不須另外處理，讓實驗流程更為便利。加上 Strep-tag? 系統在純度上的優勢，是目前在這個應用上的絕佳選擇。
參考文獻
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5. Terpe K (2003). Overview of tag protein fusions: from molecular and biochemical fundamentals to mercial systems. Appl.Microbiol.Biotechnol.,60(5): 523-33. doi: 10.1007/s00253-002-1158-6
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8. Kimple ME, Brill AL, Pasker RL (2013). Overview of affinity tags for protein purification.Curr Protoc Protein Sci., 73: Unit 9.9. doi: 10.1002/0471140864.ps0909s73.
9. GE Healthcare (2016). Affinity Chromatography Handbook, Vol. 2: Tagged Proteins.
10. Thermo Fisher Scientific (2015). Protein Expression Handbook
11. Dynamic Biosensors (2018) Application Note: High-affinity capturing of tagged proteins on the switchSENSE? biochip using Strep-Tactin?XT.
12. IBA Lifesciences (2016) Application Note: Strep-Tactin?XT:Twin-Strep-tag?- Advantages pared to the His-tag purification system.
13. Bornhorst JA, Falke JJ (2000). Purification of proteins using polyhistidine affinity tags. Methods Enzymol., 326:245-54.
題圖來源：shutterstock 正版圖庫
圖片來源：iba
文章來源：iba
話題： Strep-Tactin?XT, 親和標簽