1944年，美國學者埃弗裏等首先在肺炎雙球菌中證實了轉化因子是脫氧核糖核酸(DNA)，從而闡明了遺傳的物質基礎。1953年，美國分子遺傳學家沃森和英國分子生物學家克裏克提出了DNA分子結構的雙螺旋模型，這壹發現常被認為是分子遺傳學的真正開端。
1955年，美國分子生物學家本澤用基因重組分析方法，研究大腸桿菌的T4噬菌體中的基因精細結構，其剖析重組的精細程度達到DNA多核苷酸鏈上相隔僅三個核苷酸的水平。這壹工作在概念上溝通了分子遺傳學和經典遺傳學。
關於基因突變方面，早在1927年馬勒和1928年斯塔德勒就用 X射線等誘發了果蠅和玉米的基因突變，但是在此後壹段時間中對基因突變機制的研究進展很慢，直到以微生物為材料廣泛開展突變機制研究和提出DNA分子雙螺旋模型以後才取得顯著成果。例如堿基置換理論便是在T4噬菌體的誘變研究中提出的，它的根據便是DNA復制中的堿基配對原理。
美國遺傳學家比德爾和美國生物化學家塔特姆根據對粗糙脈孢菌的營養缺陷型的研究，在40年代初提出了壹個基因壹種酶假設，它溝通了遺傳學中對基因的功能的研究和生物化學中對蛋白質生物合成的研究。
按照壹個基因壹種酶假設，蛋白質生物合成的中心問題是蛋白質分子中氨基酸排列順序的信息究竟以什麽形式儲存在DNA分子結構中，這些信息又通過什麽過程從DNA向蛋白質分子轉移。前壹問題是遺傳密碼問題，後—問題是蛋白質生物合成問題，這又涉及轉錄和翻譯、信使核糖核酸(mRNA)、轉移核糖核酸(tRNA)和核糖體的結構與功能的研究。這些分子遺傳學的基本概念都是在20世紀50年代後期和60年代前期形成的。
分子遺傳學的另壹重要概念——基因調控在1960～1961年由法國遺傳學家莫諾和雅各布提出。他們根據在大腸桿菌和噬菌體中的研究結果提出乳糖操縱子模型。接著在1964年，又由美國微生物和分子遺傳學家亞諾夫斯基和英國分子遺傳學家布倫納等，分別證實了基因的核苷酸順序和它所編碼的蛋白質分子的氨基酸順序之間存在著排列上的線性對應關系，從而充分證實了壹個基因壹種酶假設。此後真核生物的分子遺傳學研究逐漸開展起來。
用遺傳學方法可以得到壹系列使某壹種生命活動不能完成的突變型，例如不能合成某壹種氨基酸的突變型、不能進行DNA復制的突變型、不能進行細胞分裂的突變型、不能完成某些發育過程的突變型、不能表現某種趨化行為的突變型等。不過許多這類突變型常是致死的，所以各種條件致死突變型，特別是溫度敏感突變型常是分子遺傳學研究的重要材料。
在得到壹系列突變型以後，就可以對它們進行遺傳學分析，了解這些突變型代表幾個基因，各個基因在染色體上的位置，這就需要應用互補測驗，包括基因精細結構分析等手段。
抽提、分離、純化和測定等都是分子遺傳學中的常用方法。在對生物大分子和細胞的超微結構的研究中還經常應用電子顯微鏡技術。對於分子遺傳學研究特別有用的技術是順序分析、分子雜交和重組DNA技術。
核酸和蛋白質是具有特異性結構的生物大分子，它們的生物學活性決定於它們的結構單元的排列順序，因此常需要了解它們的這些順序。如果沒有這些順序分析，則基因DNA和它所編碼的蛋白質的線性對應關系便無從確證；沒有核酸的順序分析，則插入順序或轉座子兩端的反向重復序列的結構和意義便無從認識，重疊基因也難以發現。
分子遺傳學是從微生物遺傳學發展起來的。雖然分子遺傳學研究已逐漸轉向真核生物方面，但是以原核生物為材料的分子遺傳學研究還占很大的比重。此外，由於微生物便於培養，所以在分子遺傳學和重組DNA技術中，微生物遺傳學的研究仍將占有重要的位置。
分子遺傳學方法還可以用來研究蛋白質的結構和功能。例如可以篩選得到壹系列使某壹蛋白質失去某壹活性的突變型。應用基因精細結構分析可以測定這些突變位點在基因中的位置；另外通過順序分析可以測定各個突變型中氨基酸的替代，從而判斷蛋白質的哪壹部分和特定的功能有關，以及什麽氨基酸的替代影響這壹功能等等。
生物進化的研究過去著眼於形態方面的演化，以後又逐漸註意到代謝功能方面的演變。自從分子遺傳學發展以來又註意到DNA的演變、蛋白質的演變、遺傳密碼的演變以及遺傳機構包括核糖體和tRNA等的演變。通過這些方面的研究，對於生物進化過程將會有更加本質性的了解。
分子遺傳學也已經滲入到以個體為對象的生理學研究領域中去，特別是對免疫機制和激素的作用機制的研究。隨著克隆選擇學說的提出，目前已經確認動物體的每壹個產生抗體的細胞只能產生壹種或者少數幾種抗體，而且已經證明這些細胞具有不同的基因型。這些基因型的鑒定和來源的探討，以及免疫反應過程中特定克隆的選擇和擴增機制等既是免疫遺傳學也是分子遺傳學研究的課題。
將雌性激素註射雄雞，可以促使雄雞的肝臟細胞合成卵黃蛋白。這壹事實說明雄雞和雌雞壹樣，在肝臟細胞中具有卵黃蛋白的結構基因，激素的作用只在於激活這些結構基因。
激素作用機制的研究也屬於分子遺傳學範疇，屬於基因調控的研究。個體發生過程中壹般並沒有基因型的變化，所以發生問題主要是基因調控問題，也屬於分子遺傳學研究範疇。
分子遺傳學研究的方法，特別是重組DNA技術已經成為許多遺傳學分支學科的重要研究方法。分子遺傳學也已經滲入到許多生物學分支學科中，以分子遺傳學為基礎的遺傳工程則正在發展成為壹個新興的工業生產領域。