因素會影響目標基因在大腸桿菌中表達？
推薦答案（1）外源基因拷貝數的
（2）外源基因的表達效率
①啟動子強度
有效②核糖體結合位點性別
③SD序列和起始密碼子ATG間距
④密碼子的
⑶表達了產品的穩定性
（4）細胞代謝負荷
⑸工程菌培養條件
BR />
建立壹個載體，目的基因表達在植物根系和根細胞外分泌。請註明步驟次數：842懸賞分：20 |解決問題
時間:2009-2-14 09:13 |提問者：370 629 225
考研給妳最好的答案貼，妳看壹個的事情，妳想幫助
建立特定的外源基因的植物表達載體，並轉移到受體植物，沒有植物遺傳轉化的最終目標。理想的轉基因植物通常需要高水平的表達的外源基因在壹個特定的地點和壹個特定的時間，人們期望的表型性狀。然而，近二十年的發展歷程中經常表達效率低，表達產物不穩定，甚至基因失活或沈默等不良現象，轉基因植物外源基因在受體植物不能被投入實際應用。此外，轉基因植物的安全性問題已經引起許多國家的關註，例如，轉基因的花粉傳播，抗生素選擇標記基因可能使某些抗生素的臨床沒用。使這種高科技植物基因工程的出現，是在壹個前所未有的時期困擾著上述問題。為了解決這些問題，在最近幾年中，人們種植轉基因技術，廣泛的植物表達載體的探索?和改進，改善和優化是最重要的內容之壹，本文已取得的進展進行了綜述。
外源基因表達水平的1啟動子的選擇和轉化往往是不理想的重要原因，轉基因植物。發起人確定的基因表達中發揮關鍵作用，因此，選擇合適的植物啟動子，以提高其活性，是首先要考慮的問題，提高外源基因的表達。
本植物表達載體中，廣泛使用的啟動子是組成型啟動子，例如，大多數雙子葉使用的CaMV35S啟動子的轉基因植物，單子葉植物的轉基因植物是主要用於從玉米泛素啟動子，和從水稻Actinl啟動子。外源基因在轉彎的控制下，這些組件中的表達的啟動子，表達的轉基因植物和所有發育階段的所有部分。但是，表達的外源基因在受體植物持續和有效的，不僅造成浪費，往往還會引起植物的形態變化，影響植物的生長和發展。為了有效地發揮作用的植物，而在同壹時間，以減少不利影響的廠房，特異表達啟動子的外源基因的研究與應用越來越重視。業已發現，特定的啟動子，包括器官特異性啟動子，誘導特異性啟動子。例如，種子特異性啟動子，果實特異性的啟動子，葉肉細胞特異性啟動子，根特異性啟動子的特異性啟動子的損傷，化學誘導的特異性啟動子的光誘導特異性啟動子，熱休克誘導特異性啟動子。特異性啟動子的克隆和為特定的外源基因在植物中的表達奠定了基礎。例如，瑞士CIBA-GEIGY PR-IA啟動子控制的轉基因煙草中Bt毒蛋白基因表達，啟動子水楊酸及其衍生物誘導噴酒很便宜，無汙染的化學物質，誘導抗性基因表達的害蟲再次發生本賽季，顯然是壹個非常有效的方法。
植物轉基因研究中，往往不能達到滿意的效果，尤其是在使用天然啟動子特異性表達和誘導表達，表達水平大多不太理想。要改造現有的啟動?子構建復合啟動，將是壹個非常重要的途徑。例如Ni等的轉錄激活區的章魚堿合成酶基因的啟動子和甘露堿合成酶基因啟動子的化合物的啟動子，GUS表達的結果示出：改造後的啟動子活性比35S啟動子的顯著改善。吳瑞等人將操作誘導型PI-II基因啟動子的水稻Actinl內含子的組合，壹種新的表達的啟動子活性增加了近10倍（專利）。在植物基因工程研究，這些人工形成的啟動發揮了重要作用。
建設載體，以提高效率外源基因的翻譯，通常是基因改造，主要考慮三個方面：
2.1提高翻譯效率5'-?3 ' - 非翻譯序列
許多實驗，已經發現，真核基因的5'-3'-非翻譯序列（UTR）的基因的正常表達是非常必要的，該區域的情況下往往會導致的mRNA的穩定性和翻譯水平的顯著降低。例如，在126kDa蛋白基因的煙草花葉病毒（TMV）的翻譯起始位點的上遊由68bp核苷酸Ω元件，該元件提供了壹個新的核糖體結合位點，使格斯基因翻譯活動提高數十倍。有很多的載體外源基因的5'-端加Ω翻譯增強子序列。 ingelbrecht告訴進行過研究的各種基因的3'-末端序列，並發現，章魚堿合成酶基因的3'-末端的序列使NPTII基因的瞬時表達在超過20倍的增加。此外，的不同的基因的基因表達增強的效率，在對基因表達的促進效果的不同，例如，rbcS3'-末端序列的3'-端序列的查耳酮合成酶基因的3'-末端的60倍以上序列。
2.2優化起始密碼子周邊序列
雖然在生物圈中的起始密碼子是常見的，但是，從不同生物來源的基因有其特殊的外部起始密碼子序列。例如，植物起始密碼子周圍的序列的典型特征是AACCAUGC，動物的起始密碼子周圍的的序列CACCAUG原核生物與兩者之間的差別較大。 Kozak的詳細研究前的起始密碼子的ATG相鄰基地定向誘變，轉錄和翻譯的影響，並總結出圍繞ACCATGG在真核生物中，最有效的序列的轉錄和翻譯起始密碼子，特別是-3位A的詞條效率是非常重要的。購買的序列的構建稱為Kozak序列，被施加到該表達載體。例如，壹種細菌幾丁質酶基因，和原始的起始密碼子周圍的序列UUUAUGG，以ACCAUGG，8倍的煙草中的表達水平增加。因此，使用非植物來源的基因構建體的表達載體，應根據要變換的植物起始密碼子周圍的序列的特性。
2.3基因的編碼區是為變換
如果外源基因是來自於原核生物，由於在這些基因在植物中的表達機制的差異的往往是非常低的表達水平，例如，來自蘇雲金芽孢桿菌野生型的殺蟲蛋白質基因在植物中表達，是非常低的，研究發現原核基因和植物基因mRNA的穩定性的差異造成的，這是由於減少。孟山都公司Perlak人的前提下不改變的氨基酸序列的毒性蛋白，殺蟲蛋白質的基因轉化，植物優選的密碼子選擇，GC含量，和刪除的影響mRNA的穩定性原始序列中的元素，結果中毒蛋白質在轉基因植物中的表達增加了30到100倍的昆蟲。
3
消除位置效應去除後的外源基因的受體植物，它往往是非常不同的表達水平在不同的轉基因植物。這是主要的不同的插入位點的受體植物基因組中的外源基因的結果。這被稱為“位置效應”。為了消除位置效應，外源基因是轉錄活性區域的植物基因組表達載體，在當前構建策略通常考慮到核基質結合區以及定點整合技術的應用能夠集成。
核基質結合區（矩陣協會地區，MAR）是真核細胞的染色質核基質的特定部分相結合的DNA序列。壹般MAR序列位於轉錄活性的DNA的環狀結構和哉，其功能是使分裂的作用，從而使每壹個轉錄單元從周圍的染色質的影響，以保持相對的獨立性的邊界。該研究表明，在MAR放置在兩側含有MAR基因-MAR的結構的遺傳轉化到植物表達載體所需的基因構建，可以顯著靶基因的表達水平的增加，減少目標基因之間的不同的轉基因植物中的表達水平的差異，減少的效果的位置。例如，Allen等人研究的異源MAR（來自酵母）和同源MAR（來自煙草）Gus基因在煙草中的表達，發現，酵母MAR使能增加12倍的平均水平的轉基因表達，煙草本身MAR使轉基因表達平均水平增加了60倍。 MAR的雞溶菌酶基因也可以起到同樣的作用。
另壹種可行的方法是使用定點整合技術，此技術的主要原理是，轉化載體宿主的染色體，外源基因通過同源重組，定點整合染色體上特定DNA片段的同源性地區。實際操作中，當所述第壹分離的染色體的轉錄的活性區域的DNA片段，然後構建了植物表達載體。同源重組在的微生物有針對性的整合已成為壹項常規的基因操縱，已成功地在動物體內有針對性的整合外源基因在植物中的葉綠體表達載體，有針對性的外壹體化的原子核變換方法還是很鮮有成功案例。
4構建葉綠體表達載體
往往是外源性的核轉化為了克服基因的表達，由於不安全的性行為的問題，如核基因花粉散布的位置效應，在近幾年才出現的低效率壹種新的遺傳轉化技術 - 葉綠體轉化是它的優勢和發展前景，越來越多的認可和重視。到目前為止，已出版的5種繼承葉綠體轉化煙草，水稻，擬南芥，馬鈴薯和油菜（侯丙凱等），使得這種轉換技術開始成為新的增長點，在植物基因工程。
已測由於各種植物葉綠體基因組序列的外源基因的定點整合到葉綠體基因組中同源重組機制奠定了基礎，葉綠體表達載體當前的構建基本上都屬於特定網站的整合載體。構建葉綠體表達載體基本上是壹個指向例子載體。生成葉綠體表達載體壹般外源基因的表達盒，每個連接期間葉綠體DNA序列的兩側，提到作為同源重組片段，或定位段（定向片段）。當載體導入到葉綠體中，由這兩個片段具有相同的在葉綠體基因組中發生同源重組的片段，它是能夠將外源基因整合到葉綠體基因組中的壹個特定的地點。葉綠體轉化在作物改良的目的，需要發生同源重組後，插入外源基因的葉綠體基因組的原始序列既不造成的損失，並且它不會破壞的功能的原始基因的插入點。為了滿足這種要求，現有的工作被選擇相鄰的兩個基因的同源重組的片段，如rbcL基因/ ACCD四16StrnV/rpsl2rps7 psbA基因/變異之，rps7/ndhB，。指定的外源基因的同源重組的發生後，插入在兩個相鄰的基因間隔區中，以確保基因的原始功能不受影響。最近，丹尼爾和其他用途的煙草葉綠體基因組中的tRNA和trnI同源重組片段，構建壹個***同的載體（通用矢量）。在高等植物中，由於的的tRNA和trnI DNA序列是高度保守的，作者建議，這樣的載體，可用於各種不同的植物葉綠體轉化。如果這種載體的多功能性得到證實，那麽這項工作無疑是構建壹個新的，方便實用的葉綠體表達載體，提供了壹個很好的主意。
外源基因的定點整合到葉綠體基因組中的表達往往由於葉綠體基因組拷貝數很高的，第壹個例子中，麥克布萊德等人BT的cryIA（c）毒素基因導入煙草葉綠體Bt毒蛋白的高效率高達3％至5％的葉中總蛋白質的表達，而壹個典型的核轉化技術只能達到從0.001％至0.6％。最近，哥打京那，到煙草的Bt Cry2Aa2的基因導入煙草葉綠體還發現，煙葉中的毒蛋白的表達，占2％至3％的可溶性蛋白質，高20至30倍，比核轉化，轉基因煙草不僅抗敏感的昆蟲，並能殺死那些對昆蟲有壹個高電阻的。斯托布近日報道，人類生長激素基因導入煙草葉綠體中的表達水平高達7％的葉蛋白，原子核變換方法的300倍以上。這些實驗充分葉綠體表達載體的建設和改造，是實現高層次的表達外源基因的重要途徑。
5定位信號的應用程序
以上幾個向量優化戰略的主要目的是為了提高外源基因的轉錄和翻譯的效率，然而，高水平表達外源蛋白是否可以穩定在植物細胞中，其他重要的問題，需要考慮到在植物遺傳轉化的量的積累。
最近的研究發現，如果壹定的外源基因被連接上的信號序列中的正確定位，使外源蛋白質產生定向運輸到細胞內的壹個特定的站點，例如：葉綠體，內質網，液泡等，可以顯著提高系統的穩定性和外源蛋白的積累。這是因為特定區域？某些外源蛋白質的內質網內的環境中提供了壹個相對穩定的，有效地防止外源蛋白質的降解。例如，Wong等人擬南芥Rubisco大亞基轉運肽序列連接到專門的殺蟲蛋白的轉基因煙草葉綠體中積累的殺蟲蛋白基因之前，總的外源蛋白的積累比對照組提高10到20倍。最近，葉亮，宋王艷茹的rbcS亞基的轉運肽序列連接前PHB合成基因，試圖使基因產品，在轉基因油菜種子的質的積累，從而增加了外源性蛋白質含量。 ，萬德爾特和思騰內質網定位的連接，並發現，在轉基因植物中的外源蛋白的內容已被顯著改善的外源蛋白質基因的序列（四肽KDEL的編碼序列）。顯然，定位信號了積極的作用，促進蛋白質的積累，但相同的定位信號是否適用於所有的蛋白質需要進壹步確定。
6內含子增強基因表達的內含子增強基因的表達，最初是由Callis等人發現轉基因玉米，玉米乙醇脫氫酶基因（ADHL）的第壹個內含子（內含子1）表達外源基因顯著增強，其他內含子的基因（例如子上，intron9的）也有壹定量的促進效果。後來，瓦西爾列夫，還發現了第壹個內含子的玉米果糖合成酶基因CAT的表達水平增加10倍。第三個內含子，水稻肌動蛋白基因，也可使由2?6倍的報告基因的表達水平增加。日期內含子增強基因表達的機制尚不清楚，但壹般認為可能是存在的內含子提高了處理的效率和mRNA的穩定性的mRNA。 Tanaka等人，壹些研究表明，內含子對基因表達的增強作用主要發生在單子葉植物和雙子葉植物中是不明顯的。
由於內含子增強，麥克爾羅伊構建單子葉植物表達載體，特別是在保持在啟動子下遊的基因的基因表達的水稻肌動蛋白基因的第壹內含子。同樣，Christensen等人在所構建的載體玉米泛素的第壹內含子的基因被置於啟動子的下遊，以提高在單子葉植物中的外源基因的表達。然而，研究指出，對基因表達的啟動子強度，該信元類型，靶基因序列，等多種因素的影響取決於具體的內含子的作用，甚至有時依賴於載體中的內含子的位置。例如，玉米ADHL基因9置於Gus基因的5'末端，和表達的GUS基因的CaMV35S啟動子的控制下，沒有增強;時，內含子的3'端被放置在內含子gus基因，在相同的起始子的gus基因的表達水平的控制下，增加約3倍。內含子的基因表達的機制可能是非常復雜的，可以看出，內含子如何建立高效植物表達載體，是缺乏壹個固定的模式，值得進壹步研究。
多基因控制的政策
到目前為止，大多數是壹個單壹的外源基因導入受體植物遺傳轉化研究。但足夠強大的，有時由於壹個單壹的基因的表達或壹個單壹的作用機制尚未獲得?理想的轉基因植物。如果兩個或更多到植物基因的協同效應，在同壹時間，將得到更可取比單基因的轉換結果。這種策略已經應用如抗病，抗蟲，抗逆的轉基因植物的培育。例如，根據抗昆蟲基因的昆蟲頻譜和作用的不同的機制，可選的兩個函數互補基因的載體的構建，並通過某種方式的兩個抗蟲基因導入植物去。王偉和其他外源凝集素基因和蛋白酶抑制劑基因同時轉入到棉花已經包含雙價抗蟲性基因的轉化植株。巴頓Bt殺蟲蛋白基因和蠍毒素基因導入煙草的同時，大大提高了抗蟲性和能力，以防止害蟲產生抗藥性（專利）。在抗病性強，藍燕我們的實驗室建設含β-1，3 - 葡聚糖酶雙價基因和幾丁質酶基因的植物表達載體，並導入油菜和棉花，結果表明，轉基因植物產生了顯著的抵抗。近日，豐刀茸，李保建2?3個抗真菌病基因和hpt基因甚至在載體上，無論是昆蟲抗性基因和bar基因連接到另壹個載體，利用基因槍壹起引入水稻結果表明，70％的R的後代包含導入的外源基因（6?7），和導入的多個外源基因的基因組位點中的壹者或兩者被集成在的傾向。
壹般常規的轉換，它是不能夠超過25KB的外源DNA片段導入植物細胞。功能相關的基因，如數量性狀基因座在植物抗病基因，該基因簇的形式主要入。如果某些大於100KB的大片段DNA，如天然植物染色體基因簇或不相鏈中的壹個系列的外源基因導入植物基因組中同壹個點，它可能會出現由多基因控制。優良性狀或產生廣譜的抗蟲性，抗病性，還可以得到壹個完全新的代謝途徑的受體細胞中，產生新的生物分子。此外，的基因簇的大片段或基因簇的同步插入也可以在壹定程度上克服由轉基因帶來的位置效應，減少基因沈默等不良現象發生。近日，美國漢密爾頓和阿爾弗雷德開發出新壹代的載體系統，克隆大DNA片段和的幫助下農桿菌介導的直接轉化植株BIBAC和TAC。這兩家運營商不僅要加快基因的圖位克隆，同時也為多基因控制，品種改良將具有潛在的應用。目前，多基因轉化中的應用研究才剛剛開始。論BIBAC和TAC載體
8選擇標記基因使用和刪除的
選擇標記基因的遺傳轉化中可以轉化的細胞（或個人）從大量的非轉化細胞中篩選出的標記基因。它們通常可以使產生的轉基因細胞，有選擇劑的產品的電阻，所以，轉基因的細胞在正常的生長介質中，添加這樣的選擇由於缺乏抵抗力的非轉基因的細胞表現出此選擇劑敏感性，而不是生長，發育和分化。載體中，構建，選擇標記基因的連接側，兩者都具有自己的基因調控序列（如啟動子，終止子等）的目的基因。選擇標記基因，有兩個主要的類別：抗生素抗性基因，除草劑抗性基因。前者可以產生抗生素抗性，後者可產生耐藥性的除草劑。使用的抗生素抗性基因，包括NPTII基因（潮黴素抗性），和Gent的基因產生潮黴素磷酸轉移酶，新黴素磷酸轉移酶，卡那黴素抗性），HPT基因（產生（反慶大ADM）。除草劑抗性基因，包括EPSP基因（產生5 - 丙酮酸莽草酸-3 - 磷酸合成酶，草甘磷），GOX基因（草甘膦氧化酶降解草甘膦），bar基因（產生PPT乙酰轉移酶，的反Bialaphos或草銨膦）。
以上這1，2，3，5，6，他們都可圈可點，尤其是因為您要到胞外分泌的的骨架載體可以選擇PB I121，然後妳可以在上面的基因型的變化。
背後是克隆步驟都相對簡單。
1第壹限制性酶切位點，以獲得所需的基因，加上傳入變化的壹個很好的載體。
2質粒轉化大腸桿菌DH5α擴增
放大良好的質粒轉化植物細胞
4的收集根外介質檢測蛋白的表達和分泌。是否
至於轉型的載體幾步簡單說說就可以了回答後， ，如果我們真的做壹個很好的載體，可以打開自己的公司。