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外源基因表達的檢測是什麽?

檢測外源基因是否轉化成功,首先對報告基因進行檢測,然後再進行目的外源基因的檢測。目的外源基因的表達可分轉錄和翻譯兩個水平,轉錄是以DNA為模板合成mRNA的過程,翻譯則是指以mRNA為模板翻譯成蛋白質。目的基因表達檢測亦可在兩個水平上進行,在轉錄水平上對mRNA進行檢測,在翻譯水平上對蛋白質進行檢測。

1.報告基因的酶法檢測

主要的報告基因,例如Gus基因、Cat基因、冠癭堿合成酶基因、NptⅡ基因和熒光素酶基因皆可根據各自的功能,采用酶法檢測。

2.外源基因轉錄水平上的檢測。

Northern雜交(Northernblotting)以RNA為探針,檢測外源基因轉錄產物特異mRNA。Northern雜交也有斑點雜交和印跡雜交。斑點雜交只需將RNA樣品點樣在固相膜上直接與探針雜交,但只能鑒定外源基因是否轉錄;而Northern印跡雜交則需將RNA樣品進行電泳分離,然後轉移到固相膜上,再與探針雜交,可對外源基因的轉錄狀況進行較詳細的分析。Dot-Northern雜交是將總RNA提取物經多孔過濾進樣器直接轉移到雜交膜上,其余步驟與Northern雜交相同。Northern雜交對細胞中低豐度的mRNA檢出率較低。

3.外源基因翻譯水平上的檢測

外源基因翻譯水平上的檢測通常用Western雜交(Westernblotting)。Western雜交是將蛋白質電泳、印跡、免疫測定融為壹體的特異蛋白質檢測方法。轉化的外源基因正常表達時,轉基因植株細胞中含有壹定量的目的蛋白。從植物細胞中提取總蛋白或目的蛋白,將蛋白質樣品溶解在含去汙劑和還原劑的溶液中,經SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳使蛋白質分離開來,將分離的各蛋白質條帶原位轉移到固相膜上,膜在高濃度的蛋白質溶液中溫育,以封閉非特異性座位。然後加入特異性抗體(壹抗),印跡上的目的蛋白與壹抗結合後,再加入能與壹抗特異性結合的二抗,二抗事先已經標記,根據二抗上標記化合物的性質檢出。由檢測結果,可知目的蛋白是否已在被檢植物細胞中表達、其濃度以及大致的分子量。

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